細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8 KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)高親和力特異結(jié)合。FITC-Annexin V結(jié)合到凋亡細(xì)胞后，在藍(lán)色光的激發(fā)下，發(fā)出綠色熒光，區(qū)分出凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞。碘化丙啶(Propidium iodide，PI)是一種核酸染料，它不能穿透完整細(xì)胞膜，但對凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染。將FITC-Annexin V與PI匹配使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞區(qū)分開來。
1.組織經(jīng)福爾馬林固定后會產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連，因此石蠟組織進(jìn)行凋亡檢測時要進(jìn)行預(yù)處理。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認(rèn)為：TUNEL染色時蛋白酶K的作用有可能引起內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放，造成假陽性反應(yīng)，同時過量的蛋白酶K處理可破壞組織的結(jié)構(gòu)，用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn)。
2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程，經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因固定和包埋造成的抗原破壞，打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合，促進(jìn)抗原決定簇的暴露，恢復(fù)細(xì)胞膜的空間結(jié)構(gòu)，增加穿透效應(yīng)，加速組織處理及染色過程。我們在作TUNEL染色前進(jìn)行微波修復(fù)，可以達(dá)到蛋白酶K的功效，取得較為理想的效果，背景染色很淺，凋亡細(xì)胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。
3.蛋白酶K作用的條件嚴(yán)格，消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握。同時蛋白酶K的價格昂貴，而微波已作為一種常用儀器用于免疫組織化學(xué)染色中。
(1)切片常規(guī)脫蠟入水
(2)將一燒杯盛200ml的0.01M、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90～95℃，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入雙蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷卻，將玻片移至PBS(20～25℃)。(3)PBS洗5min×3次。
(4)加20%正常牛血清室溫30min。
(5)將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT)。
(6)PBS洗5min×3次。
(7)3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min。
(8)37℃溫育90min。
(9)加POD轉(zhuǎn)化劑，37℃溫育30min。
(10)PBS洗5min×3次。
(11)DAB/H2O2顯色。
(12)蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。
結(jié)果：細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)特征，可確立凋亡細(xì)胞。陰性對照片無棕色顆粒。
